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固相合成技術(shù)因其操作簡便、易于實現(xiàn)自動化，已成為合成小核酸和多肽藥物的常用方法之一。近年來，微波輔助合成和流動合成技術(shù)的引入進一步提升了固相合成的合成效率和產(chǎn)量。然而，這些技術(shù)通常依賴昂貴且高度專業(yè)化的儀器，限制了其在常規(guī)實驗室中的普及。此外，目前在Fmoc固相合成中廣泛使用的活化試劑HATU，存在熱穩(wěn)定性差和安全隱患。
鑒于此，瑞士日內(nèi)瓦大學Nicolas Winssinger團隊利用通用的液相分析系統(tǒng)，通過將其改造用于流動化學技術(shù)，實現(xiàn)高效液相色譜儀（HPLC）到多肽合成儀的轉(zhuǎn)變。
HPLC是常用的分離分析技術(shù)，樣品經(jīng)色譜柱分離組分，實現(xiàn)樣品的純度檢測。該團隊創(chuàng)新的在色譜柱前的保護柱中填充10mg樹脂作為微型流動反應(yīng)器，內(nèi)置2 μm熔塊，以防止樹脂流失，同時借助DAD檢測器（檢測Fmoc脫保護副產(chǎn)物）實時反饋合成結(jié)果。
該方案采用TBEC（1-叔丁基-3-乙基碳二亞胺）/Oxyma（2-肟氰乙酸乙酯）作為活化體系，無需額外加堿和預活化步驟，不僅簡化了流程，還更加的安全和環(huán)保。
在上述設(shè)備和活化體系基礎(chǔ)上，為探索合成條件，以苯丙氨酸五聚體為模型，在改造的HPLC系統(tǒng)上進行優(yōu)化條件。實驗結(jié)果表明，經(jīng)優(yōu)化后的條件可成功合成目標五肽，且實現(xiàn)粗品純度＞93%單步純度＞99%。
具體方法如下：
整個合成流程包括如下幾個階段：
1. 稱重及負載樹脂：稱取10 mg樹脂（如Rink Amide樹脂）填入空保護柱中，密封固定；
2. 樹脂溶脹：將負載樹脂的保護柱浸入二氯甲烷中，溶脹3-5分鐘；
3. 安裝：設(shè)置柱溫箱溫度為80℃，并將保護柱安裝至對應(yīng)支架中；
4. 試劑溶液配備：
樣品溶液：配置0.6 M Fmoc氨基酸、TBEC和Oxyma的NMP溶液，并等體積混合得到0.2M溶液；
脫保護溶液：在DMF中加入20%體積的哌啶，轉(zhuǎn)入自動進樣器小瓶中備用；
5. 編寫注射序列程序：設(shè)置儀器交替注射，活化的氨基酸衍生物溶液（用于偶聯(lián)）和20%哌啶的DMF溶液（用于脫保護）；另外，在合成開始前，需連續(xù)進行兩次脫保護，以確保初始Fmoc基團完全去除。
6. 樹脂裂解和脫保護：將保護柱浸入二氯甲烷中去除殘余DMF；然后取出樹脂，浸沒在TFA溶液中（TFA/三異丙基硅烷TIS/H2O=95:2.5:2.5），反應(yīng)3小時，以達到完全解離和脫保護。對于含半胱氨酸，甲硫氨酸等的特殊序列，可使用TFA/1,2-乙二硫醇EDT / TIS / H2O=90 : 5 : 2.5 : 2.5混合裂解液。
7. 產(chǎn)物處理：分離樹脂，使多肽粗品析出，進一步純化。
對于組氨酸等易消旋的氨基酸及部分特殊氨基酸而言，預活化時間對其偶聯(lián)效率具有顯著影響：該團隊在合成20肽時，比較了新制活性酯和預活化24小時后打的偶聯(lián)效率，發(fā)現(xiàn)Fmoc-Arg(pbf)-OH和Fmoc-His(Trt)-OH在長時間活化后偶聯(lián)效率比較低。
為進一步研究預活化時間對偶聯(lián)效率的影響，以Fmoc-Arg(pbf)-OH為原料分別在預活化15分鐘和24小時后合成FRF三肽。結(jié)果顯示，預活化24小時后，偶聯(lián)效率顯著降低，歸其原因是Fmoc-Arg(pbf)-OH在活化后，會經(jīng)歷分子內(nèi)環(huán)化，降低其反應(yīng)性。經(jīng)反復試驗驗證，理想的活化溶液應(yīng)在制備4小時內(nèi)使用。
肽合成過程中的異構(gòu)化可能會影響立體化學純度并改變生物活性。為評估在該合成條件下的消旋化程度，該團隊采用液相合成方法，對脯氨酸、半胱氨酸和絲氨酸等易消旋的氨基酸進行考察，均未發(fā)現(xiàn)消旋化現(xiàn)象。進一步比較TBEC/Oxyma體系和HATU/DIPEA體系的偶聯(lián)效果，團隊采用新鮮活化的His(Trt)進行反應(yīng)，實驗發(fā)現(xiàn)前者差向異構(gòu)化為3.6%，而后者異構(gòu)化比例為4.8%。
該團隊成功合成了GLP-1（30氨基酸）和比伐盧定（20氨基酸）等多肽，其中使用含10 mg樹脂的合成柱合成GLP-1的收率為52.1%。而在生物活性方面，用HPLC合成的比伐盧定粗品和通過常規(guī)SPPS合成的比伐盧定純品具有相似的生物活性（見下圖）。
現(xiàn)成的HPLC應(yīng)用于自動化流體合成多肽，具有以下優(yōu)勢和不足之處：
1. 優(yōu)勢：
將標準HPLC轉(zhuǎn)變?yōu)槎喙δ芎铣善脚_；
采用更安全的TBEC/Oxyma活化體系；
可獲得高純度多肽，同時能夠?qū)崟r監(jiān)控反應(yīng)；
立體選擇性好，可合成復雜序列多肽；
經(jīng)濟性好，采用廣泛可用的HPLC設(shè)備，降低設(shè)備成本，可惠及更多實驗室；
靈活性高，可用于多肽/寡核苷酸的合成，還可以通過更換柱子在合成和純化模式之間切換。
2. 局限性：
對某些復雜序列無法合成；
不同的氨基酸或肽鏈之間的反應(yīng)速率存在差異，需進一步優(yōu)化；
合成量較小，僅適用于微克至毫克級的合成。
該研究提供了一種簡單、安全且經(jīng)濟的多肽合成平臺，利用常規(guī)HPLC系統(tǒng)，實現(xiàn)了反應(yīng)和檢測的同步進行。此方案不僅保持了產(chǎn)物的立體化學完整性，還可以合成具有生物活性的復雜序列片段，有助于推動流動合成技術(shù)在更多實驗室中的普及。
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參考文獻：
[1] Romanens, P.; Barluenga, M. D.; Winssinger, N., et al. Peptides on Tap: Automated Flow Synthesis with Standard HPLC [J]. ChemRxiv. 2025.
